Что располагается на предметном столике
Обновлено: 16.05.2024
Лупа – простейший увеличительный прибор, состоящий из увеличительного стекла, которое для удобства работы вставлено в оправу с ручкой.
Световой микроскоп – сложный оптический прибор для рассматривания предметов с увеличением в десятки, сотни и тысячи раз.
Обязательная и дополнительная литература по теме
- Биология. 5–6 классы. Пасечник В. В., Суматохин С. В., Калинова Г. С. и др. / Под ред. Пасечника В. В. М.: Просвещение, 2019
- Биология. 6 класс. Теремов А. В., Славина Н. В. М.: Бином, 2019.
- Биология. 5 класс. Мансурова С. Е., Рохлов В. С., Мишняева Е. Ю. М.: Бином, 2019.
- Биология. 5 класс. Суматохин С. В., Радионов В. Н. М.: Бином, 2014.
- Биология. 6 класс. Беркинблит М. Б., Глаголев С. М., Малеева Ю. В., Чуб В. В. М.: Бином, 2014.
- Биология. 6 класс. Трайтак Д. И., Трайтак Н. Д. М.: Мнемозина, 2012.
- Биология. 6 класс. Ловягин С. Н., Вахрушев А. А., Раутиан А. С. М.: Баласс, 2013.
Теоретический материал для самостоятельного изучения
Живые организмы состоят из клеток. Некоторые клетки можно увидеть, а размеры других настолько малы, что их практически не возможно рассмотреть без использования увеличительных приборов. Метод наблюдения требует усилить человеческий глаз для того, чтобы детально рассмотреть внутреннее и внешнее строение живых организмов.
Для изучения строения клеток используют увеличительные приборы.
Лупа – простейший увеличительный прибор. Лупа состоит из увеличительного стекла, которое для удобства работы вставлено в оправу с ручкой. Лупы бывают ручные и штативные.
Ручная лупа может увеличивать рассматриваемый объект от 2 до 20 раз.
Штативная лупа увеличивает объект в 10–20 раз.
С помощью лупы можно рассмотреть форму достаточно крупных клеток, но изучить их строение невозможно.
Световой микроскоп (от греч. макрос – малый и скопео – смотрю) – оптический прибор для рассматривания в увеличенном виде небольших, не различимых простым глазом предметов.
Световой микроскоп состоит из трубки, или тубуса (от лат. тубус – трубка). В верхней части тубуса находится окуляр (от лат. окулус – глаз). Он состоит из оправы и двух увеличительных стёкол. На нижнем конце тубуса находится объектив (от лат. объектум – предмет), состоящий из оправы и нескольких увеличительных стёкол. Тубус прикреплён к штативу и поднимается и опускается с помощью винтов. На штативе находится также предметный столик, в центре которого имеется отверстие и под ним зеркало. Рассматриваемый на предметном стекле объект помещается на предметный столик и закрепляется на нём с помощью зажимов.
Главный принцип работы светового микроскопа заключается в том, что лучи света проходят через прозрачный (или полупрозрачный) объект исследования, который находится на предметном столике, и попадают на систему линз объектива и окуляра, увеличивающих изображение. Современные световые микроскопы способны увеличивать изображение до 3600 раз.
Чтобы узнать, насколько увеличивается изображение при использовании микроскопа, надо умножить число, указанное на окуляре, на число, указанное на используемом объективе.
Разбор типового тренировочного задания:
Тип задания: Установление соответствий между элементами двух множеств
Предметный столик микроскопа – что это и зачем он нужен?
Предметный столик – один из самых важных элементов микроскопа. Это полочка небольшого размера, на которую кладут образцы для исследований. Столик расположен прямо под объективом оптического прибора, рядом с системой освещения. Предметный столик микроскопа может быть подвижным и неподвижным, с препаратодержателями или препаратоводителем, съемный и несъемный. В этой статье мы расскажем о самых часто встречающихся моделях и нюансах использования этого аксессуара.
Освещение предметного столика микроскопа
Предметный столик и осветительная система – это два независимых друг от друга элемента конструкции микроскопа. Освещение предметного столика в зависимости от размещения осветителя бывает трех видов: верхнее, нижнее и комбинированное (столик освещается сразу с двух сторон). От этого зависит то, какие объекты вы сможете наблюдать, – прозрачные, непрозрачные или полупрозрачные. С предметным столиком связан еще один элемент осветительной системы – диафрагма. Иногда она бывает выполнена в виде диска с отверстиями, но чаще на микроскопы устанавливают ирисовую диафрагму. Она позволяет регулировать размер светового пучка, идущего от источника освещения. Диафрагма обычно встраивается внутрь предметного столика или помещается прямо под ним.
Аксессуары предметного столика
Как известно, на предметный столик любого микроскопа устанавливают образцы для исследований. Чтобы микропрепараты не смещались во время наблюдений, их фиксируют при помощи препаратодержателей – специальных подпружиненных «лапок». Обычно их делают из металла, но на детских моделях можно встретить и пластиковые держатели. В профессиональных микроскопах препаратодержатели обычно заменяют на препаратоводители. У этих аксессуаров есть не только «лапки», но и измерительные шкалы, а также ручки регулировки. С помощью препаратоводителя можно перемещать образец по предметному столику и определять линейные размеры изучаемых структур.
Дополнительные возможности
Различают подвижные и неподвижные предметные столики. Но нельзя сказать, что одна конструкция лучше или хуже другой. Тип конструкции указывает только на способ фокусировки микроскопа. Если столик подвижен – фокусировка осуществляется путем его перемещения по вертикали. При неподвижном предметном столике двигается уже окулярная головка, а столик остается на месте.
Некоторые модели микроскопов позволяют снимать предметный столик и заменять его на другой, например самодельный столик для микроскопа. Однако нам сложно сказать, в каких ситуациях такая замена будет целесообразна. Самая распространенная причина замены столика – его поломка, но это случается нечасто. Мы рекомендуем использовать только заводские элементы конструкции микроскопа.
Микроскопы с разными видами предметных столиков вы можете найти в этом разделе.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Устройство микроскопа
Микроскоп (рис. 1) состоит из механической и оптической частей.
Механическая часть микроскопа включает подковообразный башмак 9, коробку с микромеханизмом 10, предметный столик 11, револьвер на салазках 12, кронштейн конденсатора 13. Коробка микромеханизма несет, с одной стороны, направляющую для тубусодержателя. Внутри коробки находится механизм фокусировки микроскопа. На боковых поверхностях коробки расположены рукоятки микромеханизма 1, служащего для точной фокусировки объектива. Слева на оси рукояток закреплен барабан со шкалой, разделенной на 50 частей. Цена одного деления барабана 0,002 мм. Один оборот барабана соответствует перемещению тубуса на 0,1 мм. Микромеханизм перемещает тубус вместе с механизмом грубой и точной фокусировки, по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается.
Предметный столик 2 укреплен на специальном кронштейне, закрепленном на верхней части коробки микромеханизма. Верхняя часть предметного столика может вращаться, если опустить стопорный винт 3. Столик вращают рукой за накатанную торцовую часть. С помощью винтов 2, находящихся справа и слева на корпусе кронштейна, столик перемещается (центрируется) на 8 мм, что позволяет подвести нужный участок препарата в поле зрения. На поверхности столика расположено семь отверстий. Четыре крайних отверстия служат для установки пружинных клемм 8, прижимающих препарат, а три средних отверстия – для крепления накладного препаратоводителя.
Дугообразный тубусодержатель в нижней своей части имеет рукоятку макровинта 4, используемую для грубой фокусировки микроскопа. У верхней части тубусодержателя снизу находится головка для крепления револьвера, а сверху – специальное посадочное гнездо для крепления сменных тубусов: наклонного – для визуальных исследований и прямого – для фотографических работ. Револьвер 12 имеет гнезда с резьбой для крепления объективов. Вращением револьвера осуществляется смена объективов.
Отверстия для объективов на револьвере отцентрированы относительно оси тубуса с такой точностью, что при переходе от слабого объектива к более сильному и при повороте револьвера по часовой стрелке точка препарата, установленная при слабом объективе в центре поля зрения окуляра 16, всегда остается в поле зрения более сильного объектива.
Рис. 1 Общий вид иммерсионного микроскопа.
1 – рукоятка микромеханизма; 2 – центрировочный винт для установки препарата; 3 – стопорный винт; 4 – рукоятка грубой фокусировки; 5 – винт для укрепления тубуса; 6 – рукоятка перемещения диафрагмы; 7 - стопорный винт конденсора; 8 – пружинные клеммы; 9 – подковообразный башмак; 10 – коробка с микромеханизмом; 11 – предметный столик; 12 – револьвер на салазках; 13 – кронштейн конденсора; 14 – конденсор; 15 – объектив; 16 – окуляр; 17 – головка тубосодержателя; 18 – зеркало; 19 – ирисовая апертурная диафрагма; 20 – призма; 21 – рукоятка перемещения конденсора; 22 – рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 23 – револьвер.
Кронштейн 13 имеет цилиндрическую гильзу для конденсора. Конденсор 14 крепится в гильзе винтом 7, расположенным сбоку кольца кронштейна. Под кронштейном конденсора в коробке микромеханизма укреплена вращающаяся вилка для зеркала.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной и наблюдательной систем.
Осветительная система находится под предметным столиком. К ней относится зеркало 18 и конденсор 14 с ирисовой апертурной диафрагмой 19.
Зеркало служит для отражения идущих от источника световых лучей по направлению к объективу и через него – внутрь микроскопа. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором следует пользоваться только плоским зеркалом независимо от источника света. Вогнутое зеркало может применяться при работе без конденсора с объективами малых увеличений.
Конденсор 14 состоит из системы линз, вмонтированных в металлическую оправу, закрепленную специальным винтом в гильзу конденсородержателя. Конденсор служит для собирания лучей, отраженных зеркалом, в одной точке – фокусе, расположенном в плоскости рассматриваемого препарата. При применении иммерсионного масла между фронтальной линзой конденсора и предметным стеклом апертура конденсора равна 1,2, без иммерсии она равна 1. В нижней части оправы конденсора имеется откидная рамка для установки светофильтра дневного света (матовое и синее стекло). При микроскопировании с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного столика. При искусственном освещении конденсор опускают до появления при малом увеличении изображения источника света в плоскости препарата. Интенсивность света, подаваемого в микроскоп, целесообразнее и правильнее регулировать не положением конденсора и величиной отверстия диафрагмы, а вращением ручки трансформатора, уменьшая или увеличивая накал нити лампы.
Ирисовая диафрагма расположена под линзами конденсора. Она состоит из ряда стальных сегментов, вмонтированных в металлическую оправу, укрепленную в нижней части конденсора. При помощи особого рычажка 6 сегменты диафрагмы меняют свое положение, изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света от зеркала. Степенью раскрытия диафрагмы регулируется апертура (действующие отверстия) конденсора, которая всегда должна быть немного меньше (от 9/10 до 2/3) апертуры применяемого объектива. Это обеспечивает устранение рассеянного света и дает нужную контрастность изображения. Окрашенные препараты лучше просматриваются при открытой почти полностью диафрагме.
Неокрашенные объективы следует рассматривать при суженом отверстии диафрагмы, причем необходимо тем сильнее уменьшать отверстие, чем нежнее структура изучаемого объекта.
Наблюдательная система состоит из объективов 15, призмы 20 и окуляра 16, соедиенных в тубусе микроскопа.
Объективы составляют самую важную, наиболее ценную и хрупкую часть микроскопа. Они представляют собой систему взаимно центрированных линз, заключенных в металлическую оправу. На верхнем конце оправы имеется резьба, при помощи которой объектив крепится в гнезде револьвера.
Все объективы делятся на сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателя преломления стекла и воздуха часть световых лучей откланяется и не попадает в глаз наблюдателя. Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (х8) или среднее (х40) увеличение.
Иммерсионными, или погружными, называются объективы между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления света.
В качестве иммерсионной среды используют обычное кедровое масло. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается гомогенная среда с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия наилучшего освещения препарата.
Окуляры состоят из двух плосковыпуклых линз, вмонтированных в металлическую оправу.
Благодаря объективу и окуляру получают изображение предмета в микроскопе дважды увеличенное, мнимое, обратное по отношению к препарату.
Увеличение. Общее увеличение микроскопа равно произведению объектива (Vоб) на увеличение окуляра (Vок):
Так, например, если объектив дает увеличение х90, а окуляр х15, то общее увеличение равно 1350.
Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, которая зависит от длины волны используемого света и числовой апертуры оптической системы микроскопа. Разрешающая способность связана обратной связью с пределом разрешения d- минимальным расстоянием между двумя точками, при котором еще можно различить каждую из них. Предел разрешения определяется по формуле:
где d-минимальное растояние между двумя точками; Ai- числовая апертура объектива; А2- числовая апертура конденсора; L - длина волны используемого света.
Числовая апертураопределяется произведением синуса половины (и) отверстного угла (а) на показатель преломления (п) среды, граничащей с линзой: A=n sin и (рис.2). Иначе, числовая апертура - это оптический " охват" линзы, она является мерой количества света, падающего на линзу. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом не может быть больше 1, т.к. показатель преломления воздуха равен 1, а угол и не может быть больше 90° (т.е. sin и £1).
Рис. 2. Схема хода лучей при разной величине угла и: А—объект; О— объектив; а — отверстный угол; и — половина отверстного угла
Устройство светового микроскопа
Микроскоп (от греч. mikros - малый и skopeo - смотрю) - оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, невидимых невооруженным глазом.
Первый из известных микроскопов был создан в 1590 году в Нидерландах потомственными оптиками Захарием и Хансом Янсенами, смонтировавшими две выпуклые линзы внутри одной трубки. Позднее Декарт в своей книге "Диоптрика" (1637) описал более сложный микроскоп, составленный из двух линз - плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Дальнейшее же совершенствование оптики позволило Антони ван Левенгуку в 1674 г. изготовить линзы с увеличением, достаточным для проведения простых научных наблюдений и впервые в 1683 году описать микроорганизмы.
Современный микроскоп (рисунок 1) состоит из трех основных частей: оптической, осветительной и механической.
Основными деталями оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: обращенный к глазу исследователя окуляр и обращенный к препарату объектив. Окуляры имеют две линзы, верхняя из которых называется главной, а нижняя собирательной. На оправе окуляров обозначают производимое ими увеличение (×5, ×7, ×10, ×15). Количество окуляров у микроскопа может быть различным, в связи с чем различат монокулярные и бинокулярные микроскопы (предназначены для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также тринокуляры, позволяющие подключать к микроскопу системы документирования (фото- и видеокамеры).
Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, из которых передняя (фронтальная) линза производит увеличение, а лежащие за ней коррекционные линзы устраняют недостатки оптического изображения. На оправе объективов цифрами также указано производимое ими увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют в комплекте несколько объективов с разными степенями увеличения и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемый «револьверной головкой».
Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа предельно точно выполняла свои функции. Осветительная часть в прямых микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую и апертурную регулируемую диафрагмы). Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания идущих от источника света лучей в одной точке – фокусе, которая должна находиться в плоскости рассматриваемого объекта. В свою очередь диафрагма расположена под конденсором и предназначена для регулирования (увеличения или уменьшения) потока лучей, проходящих от источника света.
Механическая часть микроскопа содержит детали, объединяющие описанные выше оптическую и осветительную части, а также позволяющие размещать и перемещать исследуемый препарат. Соответственно, механическая часть состоит из основания микроскопа и держателя, к верхней части которого прикрепляются тубус – полая трубка, предназначенная для размещения объектива, а также упомянутая выше револьверная головка. Ниже находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости с использованием соответствующего устройства, а также вверх и вниз, что обеспечивает настройку резкости изображения с помощью грубого (макрометрического) и точного (микрометрического) винтов.
Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Кроме светопольной микроскопии широкое применение в специальных методах исследования плучили: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная (флюоресцентная) и электронная микроскопия.
Метод светлого поля в проходящем свете применяется для изучения прозрачных объектов с неоднородными включениями (простейшие и бактерии в жидкостях, тонкие срезы растительных и животных тканей, тонкие полированные пластинки некоторых минералов). При выполнении данного вида микроскопии пучок лучей из осветительной системы проходит сквозь препарат и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. В свою очередь элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения.
Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия
Возможность наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии обеспечивается использованием темнопольной и фазово-контрастной микроскопии, требующих использования специальных конденсоров и позволяющих получать черно-белые изображения исследуемых микроорганизмов с возможностями изучения их формы, подвижности, деления и т.д.
Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Данный вид микроскопии впервые был предложен австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г. При его выполнеии объект освещают не снизу, а сбоку, в результате чего прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают и поле зрения остается темным. Подобный тип освещения достигается использованием специального темнопольного конденсора (параболоида или кардиоида) с затемненной центральной частью.
Кроме того, чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора (для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой). В свою очередь объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Сказанное объясняет, почему при темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне (рисунок 3). Ограничениями же темнопольной микроскопии является то, что она позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучать его внутреннюю структуру.
В основе метода фазово-контрастной микроскопии, также предназначенного для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии лежит иной физический принцип, впервые предложенный Ф. Цернике в1935 году (Нобелевская премия по физике, 1953 г.). Суть его заключается в том, что в обычных условиях при прохождении пучка света через неокрашенный объект, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменяется лишь фаза колебания световой волны, не воспринимаемая человеческим глазом.
Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными деталями подобного устройства, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, являются фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой револьверную конструкцию, в которой установлены кольцевые диафрагмы, обеспечивающие освещение препарата полным конусом света и соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов.
В свою очередь фазовый объектив отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе расположена фазовая пластинка, имеющая форму кольца и получаемая нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. При этом установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.
При изучении препарата весь свет, прошедший через его участки, в которых нет каких-либо объектов, без изменений пройдет и через фазовое кольцо, обусловив светлое изображение фона. В свою очередь свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча — недифрагированный и дифрагированный.
Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости же полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как они идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение с уменьшением амплитуды. Благодаря применению этого метода микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов относительно фона резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст).
Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта, что затрудняет изучение cвoйcтв кpaeвыx cтpуктуp наблюдаемых объектов, нaпpимep, не позволяет тoчнo зaмepять углы или расстояния. Для устранения данного недостатка используется вариант фазово-контрастной микроскопии – так называемый «хоффмановский контраст». Другой разновидностью данного метода является аноптральная микроскопия, преимуществами которой являются большая разрешающая способность с выявлением минимальных разностей плотности в неокрашенных препаратах.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия
Основы люминесцентной микроскопии были заложены А. Келером, обосновавшим принципиальную возможность подобного метода исследования. Первое устройство для его осуществления впервые было создано в 1911 г., однако широкое распространение получило двумя десятилетиями позже, когда для окрашивания препаратов были предложены специальные вещества – флюорохромы, избирательно связывающиеся с определенными структурами клеток (М. Хайтингер, 1933-1935). Чуть позже было предложено коньюгировать флюорохромы с антителами, что положило начало метода иммунофлюоресценции (А.Н. Кунс, 1942). В бывшем СССР наибольший вклад в развитие метода люминесцентной микроскопии и создание отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе, внес М.Н. Мейсель (1953).
В основе люминесцентной микроскопии (от лат. lumen - свет; греч. micros - малый + skopeo - рассматривать) лежит принцип люминесценции (видимого глазом свечения) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. При этом физические основы возникновения свечения связаны с процессом поглощения определенными молекулами падающего на них света с последующим испусканием квантов с другой (большей) длиной волны (правило Стокса).
Первичная (собственная) флюоресценция возникает без специальной обработки препаратов и присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1 , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная (наведенная) флюоресценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.
Для проведения данного вида микроскопии используются специальные люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы, отличающиеся от обычного светового микроскопа наличием мощного источника освещения (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогеновая кварцевая лампа накаливания), излучающего преимущественно в длинноволновой ультрафиолетовой или коротковолновой (сине-фиолетовой) области видимого спектра.
Данный источник используется для возбуждения флюоресценции, прежде, чем испускаемый им свет проходит через специальный возбуждающий (сине-фиолетовый) светофильтр и отражается интерференционной светоделительной пластинкой, почти полностью отсекающими более длинноволновое излучение и пропускающими только ту часть спектра, которая возбуждает флюоресценцию. При этом в современных моделях люминесцентных микроскопов возбуждающее излучение попадает на препарат через объектив (!) После же возбуждения флюоресценции возникающий свет вновь попадает в объектив, после чего проходит через расположенный перед окуляром запирающий (желтый) светофильтр, отсекающий коротковолновое возбуждающее излучение и пропускающий свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.
В силу использования подобной системы светофильтров интенсивность свечения наблюдаемого объекта обычно невелика, в связи с чем люминесцентную микроскопию следует проводить в специальных затемненных помещениях.
Важным требованием при выполнении данного вида микроскопии является также применение нефлюоресцирующих иммерсионных и заключающих сред. В частности, для гашения собственной флюоресценции кедрового или иного иммерсионного масла к нему добавляют небольшие количества нитробензола (от 2 до 10 капель на 1 г). В свою очередь в качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нефлюоресцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт). В остальном при проведении люминесцентной микроскопии применяют обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в используемой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией.
Соответственно, важными преимуществами люминесцентной микроскопии являются:
1) цветное изображение;
2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне;
3) возможность исследования клеточных структур, избирательно поглощающих различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами;
4) возможность определения функционально-морфологических изменений клеток в динамике их развития;
5) возможность специфического окрашивания микроорганизмов (с использованием иммунофлюоресценции).
Электронная микроскопия
Теоретические основы использования электронов для наблюдения микроскопических объектов были заложены У. Гамильтоном, установившим аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях, а также де Бройлем, выдвинувшим гипотезу о существовании у электрона одновременно корпускулярных и волновых свойств.
При этом, благодаря чрезвычайно малой длине волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, теоретически рассчитанный предел разрешения, характеризующий способность прибора отобразить раздельно мелкие, максимально близко расположенные детали объекта, у электронного микроскопа составляет 2-3 Å (Ангстрем, где 1Å=10 -10 м), что в несколько тысяч раз выше, чем у оптического микроскопа. Первое изображение объекта, сформированное пучками электронов, было получено в 1931г. немецкими учеными М. Кноллем и Э. Руска.
В конструкциях современных электронных микроскопов источником электронов служит металл (обычно вольфрам), из которого после его нагревания до 2500 ºС в результате термоэлектронной эмиссии испускаются электроны. С помощью электрических и магнитных полей формирующийся поток электронов можно ускорять и замедлять, а также отклонять в любых направлениях и фокусировать. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность соответствующим образом рассчитанных магнитных, электростатических и комбинированных устройств, называемых «электронными линзами».
Необходимым условием перемещения электронов в виде пучка на большое расстояние является также создание на их пути вакуума, поскольку в этом случае средняя длина свободного пробега электронов между столкновениями с газовыми молекулами будет значительно превышать расстояние, на которое они должны перемещаться. Для этих целей достаточно поддерживать в рабочей камере отрицательное давление приблизительно 10 -4 Па.
По характеру исследования объектов электронные микроскопы разделяют на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные, среди которых первые два являются наиболее часто используемыми.
Оптическая схема просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа полностью эквивалентна соответствующей схеме оптического микроскопа, в котором световой луч заменяется электронным лучом, а системы стеклянных линз заменяются системами электронных линз. Соответственно, просвечивающий электронный микроскоп состоит из следующих основных узлов: осветительной системы, камеры объекта, фокусирующей системы и блока регистрации конечного изображения, состоящего из фотокамеры и флуоресцирующего экрана.
Все эти узлы соединены друг с другом, образуя так называемую «колонну микроскопа», внутри которой поддерживается вакуум. Другим важным требованием, предъявляемым к исследуемому объекту, является его толщина менее чем 0,1 мкм. Окончательное же изображение объекта формируется после соответствующей фокусировки прошедшего сквозь него пучка электронов на фотопленке или флюоресцирующем экране, покрытом специальным веществом – люминофором (аналогичен экрану в кинескопах телевизоров) и превращающем электронное изображение в видимое.
При этом образование изображения в просвечивающем электронном микроскопе связано главным образом с различной степенью рассеяния электронов различными участками исследуемого образца и в меньшей мере с различием в поглощении электронов этими участками. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. Устроенные подобным образом современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают максимальное полезное увеличение до 400000 раз, что соответствует разрешающей способности в 5,0 Å. Выявляемое с использованием просвечивающей электронной микроскопии тонкое строение бактериальных клеток называют ультраструктурой.
В отражательном (сканирующем) электронном микроскопе изображение создается с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта при его облучении под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности. Соответственно, образование изображения обусловлено различием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от его поверхностного микрорельефа, а сам результат подобной микроскопии предстает в виде структуры поверхности наблюдаемого объекта. Контрастность может быть усилена напылением на поверхность объекта частиц металла. Достигнутая разрешающая способность микроскопов такого типа составляет порядка 100 Å.
Микроскоп – оптический прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объекта, что достигается двумя системами оптических линз: непосредственное увеличение объекта дает объектив, а затем первичное изображение объектива вторично увеличивается при помощи окуляра. На рис. 1 показана упрощенная схема хода лучей в микроскопе. Объектив, как видно из этой схемы, дает истинное, увеличенное и обратное изображение объекта. Окуляр, оставляя это изображение обратным, еще более его увеличивает и переводит в мнимое. Последнее обстоятельство на практике значения не имеет, но то обстоятельство, что изображение в микроскопе получается увеличенным и обратным, приходится учитывать постоянно. Так как изображение получается обратным, то наблюдатель, желая передвинуть деталь, должен сделать обратное движение, т.е. чтобы деталь передвинулась вправо, надо подвинуть препарат налево, чтобы деталь переместилась вверх, надо передвинуть препарат вниз, и т.д.
Рис. 1. Упрощенная схема хода лучей в микроскопе.
/ — объектив; 2 — окуляр; А — В — объект; Bt — Ai — изображение, даваемое объективом; В2 — Аг — изображение, увеличенное окуляром.
Так как изображение получается во много раз увеличенным, надо учитывать, что даже небольшое передвижение препарата вызовет значительное перемещение его в поле зрения микроскопа. Поэтому надо научиться очень плавно и медленно передвигать препарат по столику микроскопа, чтобы не выводить нужные детали из поля зрения.
Основными конструктивными частями микроскопа являются, с одной стороны, штатив, объединяющий механические и осветительные приспособления, с другой – оптические линзы. Ниже приводятся две модели микроскопа: микроскоп М-9 (рис. 2) с вертикальным тубусом, и микроскоп МБИ-1 (рис. 3) с наклонным съемным тубусом. Штатив микроскопа состоит из следующих частей (см. рис. 2 и 3).
Подставка (1) имеет подковообразную или прямоугольную форму для придания микроскопу устойчивости.
Тубусодержатель (2) вертикально закреплен на подставке, выполняя одновременно роль ручки для переноса микроскопа.
Тубус (3) подвижно соединен с держателем, он несет оптические линзы.
Футляр призмы (4) связывает нижний конец тубуса с его держателем. Закрепление тубуса в специальном кольце производится посредством расположенного справа винта. Передвижение тубуса достигается двумя винтами, один из которых служит для грубого, а другой для тонкого передвижения. Кремальера (5) – винт для грубого передвижения тубуса, имеет два барашка (ручки в виде колеса), вынесенные на обе стороны микроскопа. У моделей с прямым тубусом кремальера находится в верхней части тубусодержателя, у моделей с наклонным тубусом кремальера находится внизу, ниже столика микроскопа.
Рис. 2. Микроскоп М-9. Рис. 3. Микроскоп МБИ-1.
На нижнем конце тубуса крепится револьвер (7) – приспособление для смены объективов. Он представляет собою вращающуюся пластинку с винтовыми гнездами для 2, 3 или 4 объективов. Центрированное положение объектива определяется особой пружинящей пластинкой с острием, входящим в линейную нарезку, расположенную против каждого гнезда объектива. Когда острие попадает в нарезку, оно защелкивает объектив, и за правильностью этого защелкивания нужно следить при каждом повороте револьвера.
Препарат помещают на предметный столик (8), имеющий отверстие, центр которого совпадает с осью тубуса. Столик бывает квадратным или круглым. Квадратные столики всегда неподвижны, круглые столики бывают как неподвижные, так и двигающиеся. Подвижные столики могут вращаться вокруг оси и, кроме того, имеют движение по двум перпендикулярным диагоналям, что позволяет плавно подводить в центр поля зрения нужное место препарата. Для этого служат винты диагонального перемещения (9), расположенные на столике справа и слева. На предметном столике имеются гнезда, в которые вставляются зажимы (клеммы) (10) – две пружинящие пластинки, служащие для фиксирования микроскопического препарата.
Под предметным столиком располагается осветительное приспособление – зеркало (11), укрепленное на подвижном держателе, что позволяет направлять световые лучи на объект. Одна поверхность зеркала плоская, другая вогнутая. При специальных осветителях для микроскопа, снабженных точечными лампами, употребляется плоское зеркало. При использовании для освещения обычных ламп или дневного освещения надо применять вогнутое зеркало.
Осветительный аппарат (12) состоит из конденсора – плосковыпуклой линзы, помещающейся в особом кольце, где он зажимается специальным винтом конденсора (13). Этот винт нельзя трогать, так как это может повести к нарушению центрировки осветительного приспособления. Кольцо конденсора соединено с ирис-диафрагмой, привинченной снизу к конденсорному кольцу. При помощи ирис-диафрагмы регулируется количество света, попадающего на объект. Сужение или расширение ирис-диафрагмы осуществляется плоским рычажком диафрагмы (14), выведенным сбоку осветителя.
Оптические системы микроскопа состоят из объективов, которые ввинчиваются в гнезда револьвера, и окуляров, которые свободно вставляются в отверстие тубуса.
Современные объективы представляют собою различно скомбинированные системы линз, объединенных в единой оправе. Обязательной частью таких систем является плоско-выпуклая фронтальная (т. е. направленная к объективу) линза, диаметр которой тем менее, чем сильнее увеличение, даваемое объективом. Наиболее употребительными объективами являются: 8х (слабый), 20х (средний), 40х (сильный) и 90х (очень сильный). Однако надо иметь в виду, что качество оптики определяется не увеличением, даваемым линзами, а их разрешающей способностью, позволяющей наблюдателю различать отдельно две предельно приближенные друг к другу линии. Эта разрешающая способность объектива характеризуется так называемой апертурой, цифра которой также указывается на футляре объектива ниже цифры увеличения. Апертура объектива 8 =0,20; у объектива 40 =0,65; у объектива 90 =1,25.
По особенностям конструкции и способу применения объективы разделяются на сухие (8х, 20х, 40х) и иммерсионные (60х, 90х). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и стеклом препарата находится воздух. Стекло имеет показатель преломления 1,52, а показатель преломления воздуха равен 1,0. Поэтому, когда лучи света из покровного стекла препарата попадают в воздух, они преломляются. При сильных объективах с малым свободным расстоянием, у которых фронтальная линза оказывается очень близко от препарата, большинство световых лучей отклоняется и не попадает в объектив; поле зрения при этом оказывается слишком темным. Избежать этого можно, помещая между стеклом препарата и фронтальной линзой объектива такую среду, которая имеет показатель преломления, близкий к стеклу. Такой средой является иммерсионное масло, имеющее показатель преломления 1,51. В каплю масла, нанесенную на покровное стекло препарата, опускается фронтальная линза объектива и тогда световые лучи, не преломляясь, попадают в объектив и дают ярко освещенное поле зрения. Поэтому такие объективы называются иммерсионными, т. е. погружными. Свободное расстояние (т. е. расстояние между препаратом и фронтальной линзой объектива) у них очень мало, поэтому при работе с иммерсионными объективами требуется особая осторожность. Неосторожным движением кремальеры или даже резким движением микрометрического винта легко можно раздавить препарат или повредить линзу этого дорогого объектива. Для изучения обычных студенческих гистологических препаратов иммерсионные объективы применяются редко.
Линзы объективов должны быть идеально чистыми, для этого используется специальная салфетка. Ни в коем случае нельзя протирать объектив пальцем или платком!
Окуляр состоит из верхней – глазной линзы и нижней – полевой, или собирательной, линзы. Назначение последней – собирать лучи, расходящиеся от объектива, а глазной линзы – увеличивать изображение, данное объективом. На окулярах указано их истинное увеличение, наиболее часто используются: 5х и 7х (слабые), 10х (средний) и 15х (сильный).
Увеличение объекта определяется произведением увеличения, полученного от объектива, на увеличение окуляра.
Читайте также: